MBS(mapping-by-sequencing)

       MBS是針對有參考基因組的物種，利用混合分組分析（BSA , bulk segregant analysis）結合全基因組重測序，測序數據比對到參考基因組，將鑒別到的分子標記與性狀進行共分離分析，對鎖定到的目標區間內的基因進行功能注釋，實現性狀決定基因的快速定位。

特點

● 與傳統的圖位克隆相比，耗時短、成本低、定位更準確

● 根據每個客戶的研究目標和內容靈活定制研究方案

● 提供標準和高級生物信息分析，可根據客戶需求提供個性化數據分析

● 已成功完成擬南芥、水稻等多個物種突變體定位項目

推薦測序模式

● Hiseq4000, PE150

● ≥30 X基因組大小

樣品要求

● DNA：≥1 μg

● OD260/280為1.8-2.0

● 適用范圍：
· 單倍體、二倍體或多倍體物種（有參考基因組） ·家系群體（F2、DH、RIL等皆可）
· 子代混池規模：質量性狀≥50個個體；數量性狀≥30個體且不超過總群體10%比例

數據分析內容

常見問題

● 1. MBS(mapping-by-sequencing)混池需要混多少個個體？
質量性狀建議50個以上，數量性狀建議30個以上。為了縮小定位的區間，混池中的個體越多越好，前提是個體的表型判別盡可能準確。另外，對于數量性狀，注意單側極端池個體占總群體比例不超過10%。

● 2. 野生型親本是否也需要進行測序？是否也需要混池？
在分析過程中，需要進行背景噪聲的扣除，因此一般都需要提供野生型親本的基因型數據。如果能提供構建群體的直接親本，則無需混池；對于無法明確直接親本的項目，需要對直接親本世代相近、覆蓋整個親本基因庫的多個個體進行混池。

● 3. 顯性性狀能否采用MBS(mapping-by-sequencing)來做，如何取材？
可以做，一般要同時對F2代中3:1分離的兩種表型分別混池測序，且分離比為3的株系我們建議通過F3代的表型分離來確定F2代的基因型，在這里選取F2代基因型為純合系的株系測序。

案例展示

案例一：質量性狀定位——水稻突變體基因的快速定位

研究背景：

        2011年，地震和海嘯導致日本大面積的稻田被海水污染，日本地方水稻品種Hitomebore口感優良、產量高、但不具備耐鹽性，無法適應驟然上升的高鹽環境，急需培育Hitomebore的耐鹽品種。如果采用傳統育種需要至少10年時間。

研究內容：

　　本文對EMS誘變的Hitomebore突變品系進行篩選，獲得一個耐鹽的突變株hst1，對hst1和野生型Hitomebore雜交構建F2分離群體。基于MBS的策略，對F2代中具有耐鹽性的20株個體混池與野生型親本同時進行基因組重測序，通過Mutmap分析方法鑒別到發生非同義突變的基因OsRR22，并通過等位基因突變體的雜交試驗確認該基因是控制水稻耐鹽性狀的關鍵基因。以hst1為基礎，通過與Hitomebore株系雜交，僅用兩年的時間培育出了水稻耐鹽品種Kaijin，該品種既有突變體hst1的高耐鹽性，又保留了Hitomebore株系的優良性狀。

● 1. EMS誘變篩選耐鹽突變體

對野生型Hitomebore株系進行EMS誘變，從6000株突變體中篩選到能耐受1.5%的NaCl濃度的水稻突變體hst1。

● 2. MBS策略定位候選基因
將hst1株系和野生型Hitomebore株系雜交，F1代株系再進行自交獲得F2代分離群體。對F2耐鹽性個體20株混池進行基因組重測序，同時測序野生型親本。利用Mutmap分析軟件鑒別SNP-Index差異最為顯著的區域，將耐鹽性狀定位到6號染色體上2.76Mb-8.57Mb區間。在該候選區間內，OsRR22基因發生了終止突變，編碼色氨酸TGG突變成終止子TAG，可能是導致耐鹽性狀的候選基因。

● 3. 候選基因的驗證
在Tos17轉座子插入突變庫中篩選OsRR22基因的等位基因突變體（NE0017和NF6804），NF6804突變株自交純合子代、hst1和NE0017雜交F1代株系同樣具有鹽度耐受。

● 4. hst1表型驗證
通過表型觀察和轉錄組測序，發現突變體hst1產量、品質、株高、花序數及大小都與Hitomebore株系無差異。

● 5. 耐鹽品種Kaijin的培育
從實際應用角度考慮，以耐鹽突變體hst1與Hitomebore株系雜交，最終培育出耐鹽品種Kaijin，該品種既有突變體hst1的高耐鹽性，又保留了Hitomebore株系的優良性狀。整個新品種培育過程只需兩年時間。

案例二：數量性狀定位：QTL-SEQ進行鷹嘴豆粒重主效基因定位

研究背景：

　　鷹嘴豆是重要的糧食作物，提高其總產量、單產量具有重要的經濟與社會價值。鷹嘴豆的百粒重常被視為衡量其單產量的一個重要性狀，但決定百粒重的QTL基因尚未經充分報道。傳統QTL定位主要采用基于分子標記的圖位克隆，費時費力，特別是對于分子標記數量有限的鷹嘴豆實現QTL的精細定位更為困難。

研究內容：

　　本研究對鷹嘴豆粒重差異明顯的兩個親本雜交所產生的F4代分離群體，分別對分離群體的粒重極端個體混合成池，與雜交親本同時進行基因組重測序。采用QTLseq分析方法，篩選與粒重性狀相關的基因組區域，在1號染色體上定位一個主效QTL（CaqSW1.1），并結合傳統的QTL定位方式將該主效QTL區間縮小到包含6個基因的35Kb范圍內。對這6個基因的RT-PCR定量顯示，其中的CSN8基因在種子中特異性表達，并且表達量在兩個極端池中存在差異。

研究結果：

● 1. QTL-seq定位：低粒重與高粒重親本雜交，單粒傳獲得F4代分離群體，測定百粒重，根據性狀的分布，選擇粒重最低和最高的10株，分別混合成池進行基因組重測序，同時測序雜交的兩個親本。結合QTLseq分析方法，計算兩個極端池間的Δ(SNP-index)，在1號染色體前端定位到一個區間大小約為35Kb的主效QTL，該區間共包含6個基因。

● 2. 傳統QTL定位驗證：基于傳統的QLT定位，利用1號染色體上95個多態性標記同樣將粒重的主效QTL定位在1號染色體相同位置。與傳統QTL定位結果相比，QTLseq定位結果更為精確（1.8cM vs 0.6cM）。

● 3. 候選區間基因功能驗證：通過RT-PCR對6個候選基因分別在粒重高、低植株的葉片和種子中進行基因表達量的測定，結果顯示， CSN8基因在種子中特異性表達，并且在高粒重的植株中表達量顯著上升。

參考文獻

[1] Takagi H, Tamiru M, Abe A , et al. MutMap accelerat es breeding of a salt-tolerant rice cult ivar. Nat Biotech. 33,445-449 (2015). (IF: 41.514)
[2] Das S, U padhyaya HD, Bajaj D, et al. Deploying QTLseq for rapid delineation o f a pot ential candidate gene underlying major t rait-associated QTL in chickpea. DNA Res. 22, 193-203 (2015). (IF: 5.267)