一、   送樣類型

基因組 DNA、細(xì)胞、全血、動物組織二、 保存方式

基因組 DNA、細(xì)胞、全血、動物組織：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))；保存期間避免反復(fù)凍融。

三、   運(yùn)輸條件

1、基因組 DNA：冰袋或者干冰運(yùn)輸(推薦干冰運(yùn)輸)；  

2、細(xì)胞、全血、組織樣本：干冰運(yùn)輸，順豐陸運(yùn)（3-4天時間），夏季10-15公斤干冰；秋冬季10公斤干冰；

四、   樣本量要求

1、基因組DNA：常規(guī) RRBS，總量不少于 1ug，濃度不低于 25ng/ul；

1）提供樣本 DNA完整性質(zhì)檢結(jié)果，例如瓊脂糖凝膠電泳或者Agilent2100電泳等；

2）提取基因組 DNA，要加 RNA酶，去除 RNA污染；

3）提取基因組 DNA，溶到 TE 或者 elutionbuffer, 避免溶解到純水；

4）提供 Qubit檢測濃度，基于OD值的檢測方法，例如 NanoDrop, 會嚴(yán)重高估濃度。

2、細(xì)胞樣本：常規(guī) RRBS，不少于 2x10*6個細(xì)胞；  

1）收集貼壁或者懸浮細(xì)胞、使用預(yù)冷的 1×PBS，洗滌 2次，600g離心 5分鐘；  

2）最后一次離心后，盡量去除上清 PBS，保留細(xì)胞沉淀;

3、全血樣本：1-5ml外周血  

1）使用普通 EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管。

4、動物組織： 30mg以上

用預(yù)冷的 1×PBS   溶液洗掉組織表面殘留的血液；取不少于 30mg（綠豆大小）組織塊，放置-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中長期保存(1年以內(nèi))。

案例分析1：DNA甲基化異常用于甲狀腺結(jié)節(jié)診斷

Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics. Clin Cancer Res. 2019;15;25(2):544-551

1、研究方案：惡性結(jié)節(jié)和良性結(jié)節(jié)常常難以診斷，本課題通過RRBS檢測了109個甲狀腺組織的DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)癌旁、良性結(jié)節(jié)和癌組織之間存在顯著差異，并在65個甲狀腺結(jié)節(jié)的回顧性隊列樣本中得到驗證。

2、研究結(jié)果：這些組織特異性DMR與活性增強(qiáng)子和癌癥相關(guān)基因密切相關(guān)，表明DNA甲基化為甲狀腺結(jié)節(jié)提供準(zhǔn)確的診斷。并開發(fā)及驗證了基于靶向甲基化測序TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 用于甲基化多位點甲狀腺結(jié)節(jié)診斷的轉(zhuǎn)化應(yīng)用方案的重要價值。

案例分析2：癌前病變到浸潤性肺腺癌DNA甲基組的演變

Evolution of DNA methylome from precancerous lesions to invasive lung adenocarcinomas. Nat Commun. 2021 Jan 29;12(1):687.

研究背景：在肺腺癌的早期癌變過程中，DNA甲基化譜和甲基化腫瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）的演變尚未得到系統(tǒng)的研究。

研究方案：本課題通過RRBS方案對124個手術(shù)切除樣本(14個非典型腺瘤性增生AAH; 15 個原位腺癌AIS; 22個微侵襲性腺癌MIA和11個侵襲性腺癌ADC及病灶旁樣本)進(jìn)行單堿基分辨率的甲基化測序。

研究結(jié)果：

1、在晚期病變中甲基化變異逐漸增加，甲基化水平明顯升高;

2、從甲基化變異推斷的系統(tǒng)發(fā)育模式類似于基于體細(xì)胞突變的模式，表明DNA甲基化和體細(xì)胞突變的演化是平行的;

3、在晚期疾病中T調(diào)節(jié)細(xì)胞（Tregs）與CD8+T細(xì)胞的比率較高，這意味著隨著腫瘤進(jìn)展免疫抑制；

4、此外，全局低甲基化增加與更高的突變負(fù)擔(dān)、拷貝數(shù)變異負(fù)擔(dān)和更高的Treg/CD8比率相關(guān)，表明DNA甲基化在肺腺癌早期癌變過程中對染色體不穩(wěn)定性、突變和腫瘤免疫微環(huán)境的潛在影響。

案例分析3：產(chǎn)后發(fā)育過程中腸道菌群暴露驅(qū)動腸道上皮細(xì)胞的甲基化組及轉(zhuǎn)錄組變化

Exposure to the gut microbiota drives distinct methylome and transcriptome changes in intestinal epithelial cells during postnatal development. Genome Medicine. (2018) 10:27.

研究方案：腸道菌群在腸道發(fā)育中起重要作用，研究者收集1周、4周、12-16周齡（代表嬰兒期、青少年期、成年期）的正常及無菌小鼠的小腸腸道上皮細(xì)胞（IEC），進(jìn)行RRBS和RNA-seq測序，每組5個重復(fù)；

研究結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對轉(zhuǎn)錄組的影響隨時間增加，而大多數(shù)菌群依賴性的DNA甲基化差異在出生后早期即出現(xiàn)，并鑒定出126個基因位點的DNA甲基化及RNA轉(zhuǎn)錄與菌群相關(guān)，通過靶向甲基化測序TBS (Deep Target Bisulfite Sequencing) 和RTqPCR在另外一組獨(dú)立樣本(10個/組)中加以驗證。

案例分析4：發(fā)育基因的表觀突變是養(yǎng)殖歐洲鱸魚開始馴化的基礎(chǔ)

Epimutations in developmental genes underlie the onset of domestication in farmed European sea bass. Mol Biol Evol. 2019 May 30.

研究方案：本研究通過RRBS測序，比較了早期馴化的(n=12)與野生的(n=12) 歐洲鱸魚在馴化過程中DNA甲基化變化。

研究結(jié)果：發(fā)現(xiàn)早期馴化的鱸魚與野生的沒有遺傳差異，但在不同胚胎起源的組織中發(fā)生DNA甲基化變化。這些甲基化突變與經(jīng)過25年選擇性育種后的胞嘧啶至胸腺嘧啶多態(tài)性顯著重疊，表觀突變基因與正選擇基因一致。結(jié)果表明馴化初始階的表觀變異是一個重要事件。