GeoMx DSP技術平臺將蛋白質組的多重定量信息與組織原位信息進行整合，可在一張石蠟組織切片上實現多達上百種蛋白質的原位共分析。不同于多重免疫組化（mIHC）和多重免疫熒光技術（MultiplexedImmunofluorescence, mIF），DSP技術通過核酸探針偶聯的抗體對靶蛋白質進行原位捕獲，再通過特殊的光解離釋放核酸探針，并運用nCounter數字標簽技術實現計數定量，從而直接反映出靶蛋白質的豐度。DSP采用對抗體偶聯核酸實現定量，完全消除了傳統多重分析中光譜交疊的影響，大大提高了可測靶點的通量，且通過nCounter獨有的分子標簽技術進行計數定量，無需核酸擴增等一系列酶促反應，大大提高了數據的保真性和準確性。

1. GeoMx DSP數字化空間蛋白質組技術優勢

1.1將組織病理學、腫瘤免疫與蛋白質表達譜完美結合，在腫瘤微環境研究、腫瘤異質性與腫瘤免疫研究中有著強大的優勢；

1.2可在一張石蠟組織切片上實現多達上百種蛋白質的原位共分析；

1.3除了免疫細胞圖譜核心Panel，還可以搭配多種不同的模塊 （Modules）來滿足不同的研究需求；

1.4可以額外提供多達10個定制靶標滿足個性化開發需求；

1.5通過nCounter獨有的分子標簽技術進行計數定量，提高了數據的保真性和準確性。

2. 研究流程

2.1   DSP蛋白質檢測技術流程

待測目的蛋白質的抗體通過 UV（紫外光） 可切割接頭（Linker）共價連接到含有DNA Barcode（DNA條形碼）的寡核苷酸鏈上。通過將熒光直標的形態學標志物（Morphology Markers）與這些抗體同時進行孵育，再通過UV光解將感興趣的區域（Region of Interest, ROI）的寡核酸鏈收集起來，經過與下游nCounter檢測探針等試劑進行雜交，再利用NanoString nCounter系統進行數字量化，最后將數據返回到DSP進行分析，實現這些離散ROI內詳細表達譜的信號解讀。（具體見圖一）

圖一 GeoMx DSP的簡單技術流程

(1) 染色

FFPE切片使用標準流程進行抗原修復，然后與熒光成像試劑（形態學標志物的抗體，Morphology Markers）以及與偶聯了DNA Barcode的待測目的蛋白質的抗體混合物進行孵育。

(2) ROI選擇

DSP可支持多達4通道熒光的20倍圖像。由形態學標志物染色成像建立組織的整體結構（例如，PanCK ：上皮來源細胞的形態學標志物，例如：腫瘤細胞；SYTO-13 ：細胞核染料和 CD45 ：免疫細胞的形態學標志物）。基于形態學標志物的成像信息圈選 ROI以進行多重分析。

(3) 局部寡核苷酸釋放

對選定的 ROI 進行紫外光照射釋放寡核苷酸鏈。

(4) 寡核苷酸收集

通過微毛細管（吸樣針）收集已釋放到載玻片上方水性液體中的光裂解寡核苷酸，并放入 96 孔板中用于后續定量。針對不同的 ROI 進行局部紫外光照射和寡核苷酸收集（步驟 （3）-（5）），并在每個循環之間進行大量清洗。

(5) 定量

與NanoString的熒光條形碼檢測探針等雜交，使用標準NanoString nCounter分析系統量化，使每個ROI能夠對高達約100萬個結合事件進行數字計數。

(6) 數據生成和分析

nCounter讀數返回DSP后將被處理成數字計數并映射回每個ROI，生成組織結構內的蛋白質圖譜。蛋白質的表達矩陣將進行下游數據質控和分析。

2.2   蛋白質組信息分析流程

DSP數據分析是一個基于服務端的交互式分析系統，根據研究目的不同，開展以用戶為主導的個性化分析。數據分析基本流程如下圖所示：

2.3   蛋白質組信息分析內容

DSP數據分析軟件可對數據進行處理和統計分析，并導出熱圖、箱線圖、柱狀圖等適于文章發表的結果呈現形式，可以很精確地分析不同區域中的蛋白質表達譜。通過不同質控的設定，包括管家基因（HK）以及IgG對照，來實現實驗流程各個環節的把控。

2.3.1 標準分析

1．數據QC質控和過濾

2．數據標準化處理

3．蛋白質表達譜總覽

4．PCA主成分分析

5．樣本AOI/ROI表達相關性分析

6．蛋白質Marker表達相關性分析

7．蛋白質差異表達分析

8．腫瘤免疫微環境細胞富集分析

9．腫瘤免疫微環境細胞差異分析

2.3.2 定制化分析

可結合客戶的需求，協商確定定制化信息分析服務內容。

2.3.3 分析結果示意圖

所有分組蛋白質表達熱圖

PCA降維

蛋白質相關性分析

差異蛋白質火山圖

TME細胞豐度箱線圖

數字化空間蛋白質組檢測產品

產品服務列表

Core和Modules的信息

產品服務流程

項目周期

標準流程從樣本接收質控合格到數據交付（包括樣品HE質控時間），運轉周期約為 2個月（40 個工作日）， 每批次96AOIs以上需額外增加時長，選擇個性化信息分析條目需額外評估項目周期。

交付指標和售后服務

1. 根據合同規定完成分析。

2. 提交項目結題報告文檔，說明項目完成情況。

3. 分析過程中產生的項目結題報告、下機原始數據以及相關生物信息分析結果文件。如果數據量小于 100G，使用阿里云提供；因網絡等原因無法順利下載的，可提供移動硬盤傳輸；如果數據量大于 100G，所有數據將會使用移動硬盤傳輸。

4. 數據交付后 6 個月內，提供免費的項目咨詢服務。

5. 最終數據提供后，可繼續保留數據 3 個月，如需延長數據保存時間需做費用評估。

產品服務優勢

常見問題FAQs

Q1. 什么樣品類型適合使用GeoMx DSP技術進行空間信息分析？

DSP 技術可以用于各種組織類型: 包括正電荷粘附載玻片固定的 (+ charged slides mounted) 石蠟包埋組織 (FFPE) 切片和新鮮凍存(FF)組織切片。 在 NanoString 總部的 TAP (Technical Access Program) 服務項目中， 已經在DSP上成功驗證過 55 種以上的各類腫瘤組織， 如下圖所示： 包括腫瘤組織、 穿刺樣品、 骨髓和皮膚等各類組織。 DSP 也兼容各類樣品類型，包括石蠟切片、 冷凍組織、 組織芯片和細胞培養切片等。具體可執行樣本類型，請咨詢當地業務負責人。

Q2. 對于使用 nCounter 技術作為 GeoMx DSP 空間分析下游定量技術的項目，分析過程中是否有PCR擴增？

對于 DSP蛋白質檢測的下游 Oligo 標簽（含有 DNA Barcode的寡核苷酸鏈）定量步驟，如果采用 nCounter 平臺的話，不需要反轉錄或 PCR 擴增步驟和建庫過程，可以直接用 nCounter 平臺對 Oligo 標簽進行定量，無需建庫過程。nCounter技術對于Oligo標簽或RNA分析的定量原理如下圖所示，通過雜交兩段探針：Capture Probe和Reporter Probe，檢測 Reporter probe 的熒光信號組合來實現對 Oligo 標簽的直接單分子定量分析。一個檢測到的熒光Reporter probe對應一個Oligo標簽分子或RNA分子，可以實現無擴增直接單分子定量。

Q3. GeoMx DSP 技術可以同時檢測 Protein 和 RNA 嗎？

通常情況下，DSP 可以在組織切片上檢測 Protein 和 RNA，但需要兩張相鄰的組織切片，一張切片做 RNA，另一張切片做 Protein. 兩張切片使用同樣的 Morphology （Imaging） Markers，同樣的組織微環境高度可比，后續可以整合 Protein 和 RNA 表達數據。

Q4. GeoMx DSP 蛋白質檢測技術是否可以進行單細胞分析？需要選擇的最少的細胞數目是多少？

DSP 蛋白質檢測技術的目的是用來高分辨率解析復雜組織微環境中的不同細胞組成， 以及這些細胞亞群中不超過96 種蛋白質的空間原位表達譜。DSP技術本身具有在單個細胞水平上選擇 ROIs 的分辨率，關于ROI 范圍大小的問題，因為nCounter技術本身沒有任何的PCR擴增步驟，我們需要在每一個ROI中收集到足夠多的Oligo 標簽來進行準確的96 種蛋白質的表達譜分析，因此，每個ROI中的最少細胞數其實和研究者要在空間中回答的生物學問題有直接關系。DSP 技術可以捕捉到單細胞水平的ROIs，如果使用 nCounter 技術定量，我們通常會推薦最少10-50個細胞的 ROI 大小做蛋白質檢測。如果使用 NGS 技術定量，會引入 PCR 擴增步驟建庫加入NGS Adaptor序列，需要的ROI大小可以比 nCounter 技術推薦的小一些。

Q5. 比起組織顯微切割細胞進行空間檢測，GeoMx DSP 有什么優勢嗎？

組織顯微切割，用戶需要將感興趣的組織亞細胞群或區域切除收集，并經過復雜的自行優化或其他商業平臺進行下游的RNA提取，反轉錄，擴增到最后的測序文庫制備，然后進行RNA表達譜分析。這個過程首先會損壞組織切片，其次這個復雜的試驗流程會引入各種偏差，并且成功率和數據重現性會是一個很大的挑戰。DSP平臺的推出，目的就是為了簡化上述的復雜的流程，在不破壞珍貴樣品組織切片的情況下，可以很容易的精準的用紫外光照射選取ROI，并進行下游的Protein和RNA的表達譜分析，組織切片可以重復利用來分析未收集過Oligo標簽的其他ROIs, 也可以把DSP用過的切片樣品用作其他蛋白質或核酸的檢測。更重要的是，DSP 作為一個商業平臺，高度整合了自動化的實驗流程，大大簡化手動步驟，確保了數據的準確性和高重復性，并推出經過了大量驗證后的專注于多個領域的蛋白質 和RNA檢測 Panels，能夠直接被研究者用在免疫學、腫瘤免疫、和神經科學的研究中，再配合DSP平臺的全套的數據整合和分析軟件環境，能夠幫助用戶快速搭建自己的，從樣品到分析結果的，多重空間蛋白質組和轉錄組的分析平臺。