Quantitative analysis of proteomics

定量蛋白質(zhì)組學(xué)是一種用來檢測樣品中蛋白相對/絕對含量的分析化學(xué)技術(shù)，而質(zhì)譜則是實現(xiàn)該技術(shù)依賴的一個重要手段。基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)主要分為兩大類，即標(biāo)記定量和非標(biāo)記定量。其中，標(biāo)記定量常用的是iTRAQ和TMT兩種試劑盒，其均是利用質(zhì)譜檢測報告離子的信號相應(yīng)強度來對蛋白進行相對定量的。而非標(biāo)記定量的原理則是對被檢測到的離子峰強度進行積分，以積分面積進行相對定量的。近幾年備受關(guān)注的數(shù)據(jù)非依賴采集（Data Independent Acquisition）方式則是傳統(tǒng)非標(biāo)記定量的升級版，能夠掃描到更全面地碎片信息，不會造成低豐度蛋白的丟失。

產(chǎn)品介紹

The service content

——iTRAQ 同位素標(biāo)記定量技術(shù)

iTRAQ同位素標(biāo)記定量技術(shù)

iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術(shù)是由美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司AB研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)采用4種或8種同位素的標(biāo)簽，通過特異性標(biāo)記多肽的氨基基團，然后進行串聯(lián)質(zhì)譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量。

實驗原理

iTRAQTM試劑在結(jié)構(gòu)上包括3個化學(xué)基團，分別是報告基團、平衡基團和反應(yīng)基團。（如下圖1）

圖1：4plex iTRAQ分子結(jié)構(gòu)。

不同樣品的同一肽段經(jīng)iTRAQ試劑標(biāo)記后具有相同的質(zhì)量數(shù)，并在一級質(zhì)譜檢測（MS1）中表現(xiàn)為同一個質(zhì)譜峰。當(dāng)此質(zhì)譜峰被選定進行碎裂后，在二級質(zhì)譜檢測（MS2）中，不同的報告基團被釋放，它們各自的質(zhì)譜峰的信號強弱，代表著來源于不同樣品的該肽段及其所對應(yīng)的蛋白的表達量的高低。

iTRAQ技術(shù)的特點

1、通量高

2、重復(fù)性好

3、靈敏度高

4、定量準(zhǔn)確

5、數(shù)據(jù)豐富

6、自動化程度高

優(yōu)勢

1、蛋白提取、濃度測定、蛋白酶切一站式服務(wù)

2、強大的項目團隊：擁有研究員、博士、高級外聘專家等數(shù)名

3、技術(shù)成熟：近10年的組學(xué)技術(shù)服務(wù)經(jīng)驗，擁有完善的樣品處理體系

4、先進的儀器設(shè)備   

應(yīng)用領(lǐng)域

疾病標(biāo)志物篩選　　　　植物抗逆研究

發(fā)病機理研究　　　　　藥物靶點研究

特殊功能蛋白質(zhì)篩選       作用機制研究

植物品種改良              　工程菌改造   

實驗流程

注：以iTRAQ 8標(biāo)為例

樣本類型及含量要求

送樣要求

儀器設(shè)備

Thermo Q-Exactive高分辨質(zhì)譜   

Sciex Triple TOF 6600質(zhì)譜儀

服務(wù)流程

① iTRAQ / TMT 定量蛋白質(zhì)組和雙向電泳技術(shù)相比，有什么優(yōu)勢？

雙向電泳技術(shù)是伴隨著 MALDI-TOF 技術(shù)發(fā)展起來的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，理論上可以通過等電點（IEF）和分子量（SDS-PAGE）的差異將總蛋白質(zhì)逐一分開。但實際情況并不理想，因為低豐度蛋白無法染色成功而看不見，蛋白翻譯后修飾后偏離理論位置等等，一張 2-D膠能鑒定到的蛋白質(zhì)總數(shù)最多 1000 - 2000 蛋白。相較于2-D以及 DIGE 等基于電泳的技術(shù)，iTRAQ / TMT 分辨率高，細(xì)胞樣品最多有發(fā)現(xiàn)超過 6000 個蛋白，并且絕大多數(shù)蛋白都有定量和定性信息；其次 iTRAQ/TMT 通量高，可以一次最多完成 8 或10個不同處理組的實驗，特別適合于多組樣品間的同時比較以及生物學(xué)過程的動態(tài)檢測。

② iTRAQ / TMT 實驗的主要步驟有哪些，主要采用哪些儀器，檢索的軟件及常用數(shù)據(jù)庫有哪些？

實驗步驟包括：蛋白提取、濃度測定及 SDS-PAGE 凝膠檢測，質(zhì)檢報告；蛋白酶解、標(biāo)記；一維色譜分離，凍干機凍干；高分辨 LC-MS/MS 質(zhì)譜檢測；搜庫定性、定量分析；差異蛋白篩選，差異蛋白生物信息學(xué)分析；完整報告整理。目前質(zhì)譜儀器有：Sciex公司 6600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive、Fusion質(zhì)譜儀。常用的檢索軟件有：SCIEX公司ProteinPilot 5.0、Thermo 公司Proteome Discoverer。常用的數(shù)據(jù)庫有：Uniprot數(shù)據(jù)庫、NCBI數(shù)據(jù)庫、本地自建數(shù)據(jù)庫。

③iTRAQ、TMT、Label free 實驗用的是什么質(zhì)譜儀，其定量是基于一級質(zhì)譜還是二級質(zhì)譜？

iTRAQ、TMT、Label free都屬于蛋白組學(xué)實驗，前二者是屬于同位素標(biāo)記定量蛋白組二者的原理都一樣；第三個是非標(biāo)記定量蛋白組。 三者所用的儀器都差不多，主要有：Sciex公司 5600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive； PS: TMT 10標(biāo)蛋白組只能用thermo公司Q Exactive，不能用AB 5600 做。 Itraq、TMT是基于二級質(zhì)譜定量，Label free是基于一級質(zhì)譜定量。

TMT同位素標(biāo)記定量技術(shù)

       TMT（tandem mass tags）是由Thermo公司開發(fā)的一種體外標(biāo)記技術(shù)，廣泛用于差異表達蛋白質(zhì)分析研究中。該技術(shù)采用多重同位素標(biāo)簽與肽段的氨基發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)，可實現(xiàn)同時對不同樣品中蛋白質(zhì)的定性和定量分析（目前最多可實現(xiàn)同時標(biāo)記16個樣本）。

實驗原理

     如下圖所示，TMT試劑在結(jié)構(gòu)上包括3個化學(xué)基團，分別是報告基團、平衡基團和反應(yīng)基團。反應(yīng)基團特異與肽段的氨基發(fā)生共價結(jié)合反應(yīng)，將TMT試劑連接到肽段上。在一級圖譜中，不同樣品來源于同一個蛋白質(zhì)的同一個肽段由于被連接上總質(zhì)量相同的完整TMT試劑而表現(xiàn)為一個峰。但在碰撞室內(nèi)，平衡基團會發(fā)生中性丟失，而報告基團則會產(chǎn)生相應(yīng)的報告離子（六標(biāo)為126、127、128、129、130和131 Da，十標(biāo)為126、127N、127C、128N、128C、129N、129C、130N、130C和131 Da，十六標(biāo)為126、127N、127C、128N、128C、129N、129C、130N、130C、131N、131C、132N、132C、133N、133C、134N）。這些報告離子的強度就代表了相應(yīng)樣品蛋白質(zhì)/肽段的強度，實現(xiàn)了對6個/10個/16個不同樣品的同時定量。

TMT技術(shù)特點

1、通量高：可一次性分析6、10、16個樣品。

2、重復(fù)性好：所有樣品的分離鑒定條件一致。

3、數(shù)據(jù)豐富：   可獲得所有蛋白的定性和定量信息。

4、自動化程度高：以高分辨率液質(zhì)聯(lián)用為基礎(chǔ)，自動化操作，分析速度快。

5、定量準(zhǔn)確：減少了樣本處理、以及不同組上機造成的實驗誤差，因此能達到定量更準(zhǔn)確的效果。

6、靈敏度高：可檢測到表達豐度為皮克（pg)級的蛋白，無高豐度蛋白樣本（血液、腦脊液、肌肉組織、骨組織等）可檢測。

DIA技術(shù)

數(shù)據(jù)非依賴采集（data independent acquisition，DIA）是近年來備受矚目的質(zhì)譜采集技術(shù)之一，一度引領(lǐng)了定量蛋白質(zhì)組學(xué)新發(fā)展。

DIA相比于DDA的**的優(yōu)勢在于高效測定復(fù)雜樣品中豐度極低的蛋白分子，極大地提高了定量分析的可信度。其原理是在質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集時，高速、循環(huán)的將每個采集窗口內(nèi)的所有母離子及其子離子碎裂后進行全掃描，而非根據(jù)母離子信號強度篩選后進行二級碎片再掃描。因此DIA具有高通量、高分辨率、高可重現(xiàn)性、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點，而且樣本無需分級上機，極大的縮短了每個樣品的檢測時間，適合大樣本量的蛋白質(zhì)組研究。但由于DIA獲得的是幾乎沒有任何丟失的所有離子信息，數(shù)據(jù)量及其復(fù)雜性大大增加，數(shù)據(jù)分析難度加大。目前主流的數(shù)據(jù)分析是基于 DDA/DIA 構(gòu)建的譜庫和實驗產(chǎn)生的 數(shù)據(jù)對樣品中的蛋白質(zhì)進行鑒定和定量。公共的譜庫可以從各大蛋白質(zhì)組研究數(shù)據(jù)平臺下載，但對于一些特異性的樣本，為了有更好的鑒定結(jié)果，還需要通過實驗樣本建立DDA參考數(shù)據(jù)庫。

提取的蛋白酶解之后，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對肽段進行質(zhì)譜分析，通過比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號強度，從而對肽段對應(yīng)的蛋白質(zhì)進行相對定量。每條肽段的豐度（量）與其在質(zhì)譜中的峰面積或信號強度成正比；而不同樣品的同一條肽段在LC上的保留時間（retention time， RT）是一致的，因此，可以通過對比譜圖庫中的信息，再整合到相應(yīng)蛋白，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)在不同樣本中的相對表達水平的定量分析。

（1）重現(xiàn)性好：采集所有離子及碎片譜圖，不丟失任何信息；

（2）選擇性好：基于碎片離子（即母子離子對）定量，與 SRM/MRM 相當(dāng)；

（3）準(zhǔn)確度高：循環(huán)時間固定，掃描點數(shù)均勻，定量準(zhǔn)確度高；

（4）通量高：同時監(jiān)測所有目標(biāo)蛋白/ 化合物，通量無上限；

（5）時效性強：對于易降解樣品可以即刻采集，獲得數(shù)據(jù)后再深入挖掘；

（6）數(shù)據(jù)易追溯：即使目前的水平無法發(fā)現(xiàn)某些蛋白/化合物，未來可以回溯

臨床疾病標(biāo)志物的篩選

作用機制研究

藥物作用靶點研究

疾病的分子分型

磷酸化靶點研究

癌癥血清標(biāo)志物的篩選與驗證

DIA技術(shù):先利用常規(guī)DDA質(zhì)譜檢測技術(shù)分析建立圖譜庫，之后采用DIA方法進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，從而實現(xiàn)對樣品中蛋白質(zhì)的定性及定量，不同于傳統(tǒng)的DDA技術(shù)，DIA技術(shù)將質(zhì)譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，高速、循環(huán)地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測，因此可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，數(shù)據(jù)利用度大大提高，缺失值更少。因此，DIA技術(shù)更適合于大樣本量、復(fù)雜體系的蛋白檢測。

PRM技術(shù)：平行反應(yīng)監(jiān)測(Parallel Reaction Monitoring) 是一種基于高分辨、高精度質(zhì)譜的離子監(jiān)視技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段（如發(fā)生翻譯后修飾的肽段）進行選擇性檢測，從而實現(xiàn)對目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段進行相對或絕對定量。PRM技術(shù)是基于質(zhì)譜的靶向驗證蛋白組學(xué)技術(shù)，完美的替代了基于抗體的Western blot、ELISA等。PRM技術(shù)運用平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)特異性地選擇與預(yù)先設(shè)定質(zhì)荷比相同的肽段離子并進行定量，可以有效排除干擾離子，提高蛋白質(zhì)的定量準(zhǔn)確性。

技術(shù)的特點

DIA技術(shù)是基于質(zhì)譜的新一代蛋白組學(xué)技術(shù)，DIA技術(shù)采用數(shù)據(jù)非依賴性采集掃描模式，擺脫了傳統(tǒng)DDA（代表性技術(shù)：iTRAQ/TMT）掃描的偏好性制約，可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的碎片信息，以達到樣本數(shù)據(jù)的完整性。

DIA技術(shù)較傳統(tǒng)的iTRAQ/TMT/Labelfree蛋白組技術(shù)而言，具有如下優(yōu)勢：

1. 保證了數(shù)據(jù)的完整性，缺失值少。

2. 克服了iTRAQ/TMT的通量低的限制。

3. 提高了低豐度蛋白的檢出率。

4. 基于Thermo公司的QE-HF高端質(zhì)譜，檢出率提升20%以上。

DIA實驗流程

PRM實驗流程

基于Thermo公司的QE-HF高端質(zhì)譜，檢出率提升20%以上。