Targeted proteomics

靶向蛋白質組學針對性地分析復雜樣品中的特定肽段，既可以判斷肽段或蛋白在樣品中的有無（前提是信號高于檢測限），又可以對不同樣品中的肽段或蛋白進行定量，用于表達差異比較。靶向蛋白質組學可以看做是新一代基于質譜的western blot技術，但是比傳統的WB更準確，且不需要抗體。我們一般是基于Orbitrap質譜儀進行分析。

該方法的采集目標是由目標蛋白酶解得到的肽段，因此選取目標肽段和合適的采集方法很重要。如果您有意向做靶向蛋白質組學但是又不了解該如何做，請詳詢我們的技術支持。

L-WB（PRM技術）靶向蛋白組學

L-WB（PRM）技術是一項蛋白質定量技術，該技術以質譜平行反應監測技術（Parallel reaction monitoring, PRM）為核心，集樣品特殊處理及分析于一體，具有特異性強、靈敏度高、準確性高等特點，能夠批量進行蛋白質定量分析，是進行蛋白質定量的一種技術。

PRM技術是一種根據已知實測信息或質譜檢測規律的假定信息對樣品中的蛋白質進行靶向定量的技術。該技術主要應用儀器為Q Exactive系列質譜儀，首先以四極桿作為質量過濾器，特異性地選擇與預先設定質荷比相同的肽段離子（母離子）通過，隨后在高能碰撞池中碎裂母離子，最后通過Orbitrap分析碎片離子（子離子）得到肽段的二級質譜信息。四極桿的高選擇性離子過濾與Orbitrap高分辨率測量技術的結合使得PRM技術有很高的特異性，并且有效的降低了背景噪音，去除了干擾離子，提高了靈敏度。在確保數據質量的前提下，為了在一次分析中檢測更多的蛋白質，可用預置PRM（Scheduled PRM, sPRM）的方法，這種方法需要知道每個肽段的保留時間信息，使得每個肽段只在其洗脫時間窗口內執行PRM檢測，大大提高了檢測效率，可同時檢測上百種蛋白質。PRM技術是目前應用較廣泛的質譜蛋白質靶向定量技術。

技術的特點

蛋白質印跡（Western blot）等基于抗體的傳統蛋白質定量技術，通過抗體識別并結合目標蛋白，定量檢測抗體的含量，可間接反映目標蛋白質的含量。然而制備抗體耗費時間且價格昂貴，抗體的效價不好則會嚴重影響定量結果的準確性。與之相比，L-WB技術以PRM質譜技術為核心，直接對目標分子進行定量，該技術無需抗體，可以滿足大部分生物學樣品的蛋白質定量測試需求。特異性方面，PRM技術通過四級桿特異性地選擇特定母離子通過，可排除質荷比不同的干擾母離子，并可通過對比參考庫二級離子信息、肽段保留時間信息和數據搜庫等方法，對鑒定到的肽段加以確認，這使得PRM技術有很高的特異性，甚至可對氨基酸突變和蛋白質修飾位點加以驗證和定量。靈敏度方面，因使用高分辨率和高精確性的質量分析器Orbitrap，PRM技術的靈敏度可達到0.2fmol，L-WB技術中的樣品分餾技術（包括多維分餾、親和富集、高豐度蛋白去除等）可進一步提高PRM靈敏度，對于測定復雜樣本中的低豐度蛋白有很好的效果。相比之下，目前多數商品化抗體難以達到特異性識別靶蛋白的效果，且抗體效價不高導致其靈敏度普遍難以達到PRM的水平。通量方面，sPRM可同時對近百種蛋白質進行定量，而Western blot只能檢測一種蛋白質。此外Western blot實驗存在HOOK效應，即抗原抗體比例不合適而導致假陰性的現象，而L-WB技術則無此干擾，且具有良好的重現性。該技術的優勢使得其特別適用于組學結果的驗證和篩選差異蛋白，以及新蛋白（突變）的確證、蛋白質修飾位點的確證與定量等諸多應用。

應用領域

細菌磷酸化蛋白組學重現性檢測

組氨酸修飾定量檢測

大鼠酰肉堿定量檢測

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實驗流程

儀器設備

Thermo Q-Exactive高分辨質譜

1、PRM技術跟MRM技術有什么區別，優勢有什么？

PRM技術與MRM技術很相似。先說一下相同點，兩種技術在一級質譜中篩選目標蛋白的原理是一樣的，都是通過四級桿進行母離子的篩選從而進行下一步的檢測；不同點也很容易理解，MRM技術是在母離子碎裂后檢測特異的子離子，通過母離子-子離子這種一一對應的離子對形式進行蛋白的定性定量，PRM技術是在母離子碎裂后通過高分辨檢測器對全部子離子進行檢測，這是PRM技術與MRM技術的不同。由于二級質譜檢測模式的不同，在準確定性定量上，PRM技術比MRM技術更為準確，受到的離子干擾遠小于MRM技術。

PRM技術的優勢是更加簡便，只需選擇出母離子的質荷比，電荷數即可進行檢測，不需要尋找準確的母離子-子離子對進行檢測。

2、PRM實驗的主要步驟有哪些，主要采用哪些儀器，檢索的軟件及常用數據庫有哪些？

實驗步驟包括：蛋白提取、濃度測定及 SDS-PAGE 凝膠檢測，質檢報告；蛋白酶解、除鹽，凍干機凍干；高分辨 LC-MS/MS 質譜DDA檢測，搜庫定性，選擇母離子，高分辨 LC-MS/MS 質譜PRM檢測，定量分析，完整報告整理。

質譜儀器有：Thermo 公司QE-HF/QE+/QE-HF-x等。

常用的數據庫有：Uniprot數據庫、NCBI數據庫、本地自建數據庫。

PRM數據處理軟件：SpectroDive；Skyline