1.1 SMART-seq

2012 年，由美國(guó)和瑞典的科學(xué)家共同開(kāi)發(fā)了稱(chēng)為 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技術(shù) 。在 2013 年，Nature Methods 雜志上報(bào)告了新的方案，被稱(chēng)為 Smart-Seq2，隨后在 2014 年他們有公布了詳細(xì)的操作流程 。獲取單細(xì)胞并裂解細(xì)胞后，含有 oligo-dT 的引物與 mRNA 的 poly- A 結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶到達(dá) mRNA 5’末端時(shí)，MMLV 的末端轉(zhuǎn)移酶活性會(huì)在一鏈 cDNA 的 3'末端增加額外的胞嘧啶，這時(shí) TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 結(jié)合到**鏈末端的胞嘧啶，然后以**鏈 cDNA 為模版進(jìn)行延伸合成互補(bǔ)的第二鏈，全長(zhǎng) cDNA 經(jīng)過(guò) PCR 擴(kuò)增后進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。

SMART-seq2 技術(shù)原理

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

• 前期個(gè)性化取樣指導(dǎo)

• 實(shí)驗(yàn)周期短，28天

• 樣晶類(lèi)型多樣化

• 多種建庫(kù)策略：全長(zhǎng)和3端

• 靈活的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

樣本要求

1. 按照裂解液使用說(shuō)明配制 2 x 裂解液。將配制好的裂解液用無(wú)菌濾芯槍頭加入 1.5 ml 低吸附離心管中，每管 5 ul，避免產(chǎn)生氣泡。如果有氣泡，請(qǐng)離心去除。

2. 分選的單/寡量細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裂解液中，確保加入到裂解液中的溶液總體積小于 5 ul。

3. 立即渦旋震蕩裂解細(xì)胞，充分混勻后快速離心。

4. 液氮速凍，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱短暫保存。

5. 用封口膜將離心管封口，放入 50 ml 離心管中（干冰上操作）（此步驟是防止運(yùn)送過(guò)程中 1.5 ml 離心管破裂），埋于干冰中寄送，轉(zhuǎn)移過(guò)程中避免反復(fù)凍融。

1.2 10X Genomics

2016年2月，10x genomic公司推出Single Cell Gene Expression Solution平臺(tái)，可對(duì)高通量的數(shù)字基因表達(dá)的復(fù)雜細(xì)胞群進(jìn)行深入分析，生命科學(xué)研究進(jìn)入了單細(xì)胞生物學(xué)時(shí)代。

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution

原理

基于10x genomics平臺(tái)，利用微流控技術(shù)進(jìn)行單個(gè)細(xì)胞分選，將帶有條形碼和引物的凝膠珠和單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴中；在每個(gè)油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用于測(cè)序的帶條形碼的cDNA；液體油層破壞后，cDNA后續(xù)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，使用Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，即可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，10min內(nèi)自動(dòng)完成多至80,000個(gè)細(xì)胞的捕獲，從而達(dá)到在單細(xì)胞水平進(jìn)行表達(dá)測(cè)序的目的。

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution技術(shù)原理

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

與其他高通量捕獲平臺(tái)相比，一次實(shí)驗(yàn)可完成多至80,000個(gè)細(xì)胞的捕獲，通量最高，周期快速，成本最低；細(xì)胞捕獲效率高，單個(gè)樣本細(xì)胞捕獲率高達(dá)65%；商業(yè)化儀器操作簡(jiǎn)便。

應(yīng)用方向

10 x Chromium Single Cell Gene Expression Solution能有效地解決組織樣本無(wú)法破解的細(xì)胞異質(zhì)性難題，有助于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類(lèi)型；基于大量的單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)，該平臺(tái)還可進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)特征聚類(lèi)、亞群表達(dá)特征、標(biāo)志物篩選等方面的分析，是一種高效的細(xì)胞基因表達(dá)水平的檢測(cè)技術(shù)，在發(fā)育與生殖、免疫、干細(xì)胞分化、腫瘤異質(zhì)性、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及腦發(fā)育等研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用和研究結(jié)果發(fā)表。

樣本要求

· 細(xì)胞數(shù)量與濃度：細(xì)胞起始數(shù)量大于1x105；濃度 5x105-1.2x106 /ml；

· 細(xì)胞活性：活細(xì)胞數(shù)量在90%以上；

· 細(xì)胞大小：細(xì)胞直徑小于40 μm；

· 組織需要解離成單細(xì)胞懸液；

· 植物細(xì)胞需要制成原生質(zhì)體；

· 細(xì)胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含有Ca2+和Mg2+等影響酶活性的物質(zhì)。

1.3 BD Rhapsody

BD公司推出的這款Rhapsod?單細(xì)胞分析系統(tǒng)采用了分子標(biāo)簽技術(shù)，能為單細(xì)胞中每個(gè)轉(zhuǎn)錄本標(biāo)記特異性分子標(biāo)簽，實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平上基因表達(dá)譜的絕對(duì)定量。同時(shí)，每個(gè)細(xì)胞也會(huì)被標(biāo)記特異性細(xì)胞標(biāo)簽，使得高通量平行建庫(kù)成為可能。結(jié)合Rhapsody特有的單細(xì)胞分離技術(shù)，單次實(shí)驗(yàn)可制備100-10000個(gè)單細(xì)胞文庫(kù)，用戶(hù)可根據(jù)需求定制引物，將檢測(cè)范圍集中在目標(biāo)基因，大幅降低后續(xù)測(cè)序成本。

BD Rhapsod?單細(xì)胞分析系統(tǒng)

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

• 超高通量:每個(gè)通道可容納5000~10000個(gè)細(xì)胞核
• 超強(qiáng)捕獲：細(xì)胞核捕獲率高達(dá)65%
• 適用廣泛：適用于細(xì)胞系、原代細(xì)胞、新鮮和凍存樣本的研究
• 精細(xì)分析：可對(duì)單細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行精細(xì)化分析

• 研究細(xì)胞異質(zhì)性
• 探索生物標(biāo)志物
• 定義細(xì)胞類(lèi)型
• 構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

• 腫瘤微環(huán)境
• 自身免疫性疾病
• 感染性疾病
• 器官、骨髓移植
• 抗體開(kāi)發(fā)

●   類(lèi)型：

        新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。

●   來(lái)源：

        血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。