一、樣本準備應該遵循的基本原則

l代表性原則：

取樣的代表性關系到實驗結果是否具有科學意義，因此您應該根據實驗目的慎重選擇您的取樣方案。病變組織樣本中應不夾帶正常組織，正常組織樣本中不能含有病變組織。有條件時，應做到實驗組與對照組的樣本在取材時間、部位、處理條件等方面盡可能保持一致，否則可能會影響實驗結果的可信度。

l準確性原則：

代表性樣本的各種特征數據必須被準確記錄，并按要求（低溫、迅速）采集、制備、貯存、運輸，最終正確地按實驗設計進行實驗和數據處理。

l迅速性原則：

樣本質量是表達譜芯片實驗中影響實驗結果的最關鍵因素，因此用于表達譜芯片研究的樣本，在采集、制備、貯存、運輸過程中應盡可能地做到迅速，**限度的縮短從樣本采集到實驗的時間。

l低溫原則：

所取樣本離體后，應立即置于液氮中，并保證在實驗前始終處于-70℃以下，以避免RNA的降解。

二、樣本采集、包裝

l 樣本采集、包裝過程中的注意事項

1. 冷凍保存管表面，用油性記號筆標明樣本編號及樣本類型。并且不要與乙醇等有機溶劑接觸。

2. 不要用紗布、紙張直接包裹樣本，而是用冷凍保存管包裹后再裝入樣本袋中。

3. 不要把標簽紙或其他紙制的說明性文件放入樣本袋內，因為紙張在液氮中是易碎的。

4. 不要用玻璃容器在液氮中保存樣本；樣本包裝中不要使用透明膠帶。

5. 標簽紙應該貼于樣本袋繩上，不要貼于容器表面以免脫落造成樣本混亂。

6. 不要在一只樣本袋中放過多的樣本，以防無法放入液氮罐或無法從液氮罐中取出。樣本袋在使用前先在液氮中預冷。

7. 客戶在填寫《樣本登記單》時應當詳細描述樣本的類型、處理方法、儲存條件以及儲存時間等相關細節，以便技術人員確定合理的實驗方案。

三、樣品儲存與運輸

樣品儲存

組織樣品儲存于液氮或超低溫冰箱中。RNA樣品儲存于超低溫冰箱中，在-20℃冰箱保存時間不宜太久。細胞樣品經Trizol處理后儲存于超低溫冰箱中。在-20℃冰箱中儲存不宜太久。血液樣品分離白細胞后用Trizol處理，然后儲存于超低溫冰箱中。

樣品運輸

樣品運輸建議采取液氮或干冰保存下的超低溫運輸。

液氮運輸

１．液氮運輸**在人員監護下進行。長途應采用液氮罐，短途可采用保溫杯。應保證液氮足夠，以免運輸過程中液氮揮發掉，影響材料質量。

２．液氮為危險品，受到交通部門的管制。飛機運輸應用空運型液氮罐，可以作為行李托運，不能隨身攜帶?；疖囘\輸可用普通液氮罐，可隨車托運，不能隨身攜帶。托運時應有固定基座，以免傾倒，使液氮泄露。

３．托運前應到學校保衛科或校辦開具《非危險品證明》（非易燃易爆，無毒無害，無腐蝕），并加蓋公章。

４．液氮罐口較為狹小，所以放入的物品不易過大，以免無法取出。**將樣品放入編過號的凍存管中，再根據不同類別放入合適的小布袋，用線繩栓住，線繩另一端用布條做標記，拴在罐口提手上，以方便取出和分辨。

５．凍存管應用進口高質量的凍存管，放入液氮前應擰緊，以免取出時發生炸裂傷人。

干冰運輸

飛機運輸干冰上限約為２公斤，超過２公斤原則上不能運輸。火車運輸不受限制。

干冰運輸應采用壁厚且質量完好的泡沫箱，材料用編號后的凍存管存放，用塑料袋包裝后埋入干冰中，泡沫箱應扣嚴并用封箱帶密封力求嚴密。外套紙殼箱包裝，以免碰裂。并標明輕取輕放提示，以保證安全運輸。

干冰運輸可委托當地快遞公司，注意一定要確保48小時送達我方手中，不能送貨上門的應提前通知我方。

２４小時到達的，干冰數量不得低于５公斤；４８小時到達的，干冰數量不得低于８公斤。夏季可以適當再多增加部分干冰（平時的1.5倍）。超過４８小時到達的，建議不要用此法運輸。

運輸時可在干冰上再放一排液體冰帶。

如委托快遞運輸，運輸過程中應隨時跟蹤貨物的情況，記錄貨單號，并保持與發出地和接收地的快遞公司的聯系

ＲＮＡ運輸

RNA運輸須經乙醇(兩倍體積)或異丙醇(等體積)沉淀,沉淀后的ＲＮＡ，可以用低溫冰袋冰盒運輸，但時間也不易太久，以２４小時為限。未經沉淀的RNA應用干冰或液氮運輸。

細胞及血液運輸

細胞短距離可３７度培養瓶（細胞培養液）運輸（24小時內）。長途運輸可以Trizol處理后干冰運輸。

血液當地短距離可以加入抗凝劑（或直接用抗凝管乘后）后冰塊運輸（2小時內），長途運輸可先分離白細胞，Trizol處理后干冰運輸。

四、其它保存樣品的方式介紹

如果用液氮或干冰運輸非常困難,建議以 RNAlater或RNAsecure保存樣品進行運輸,具體如下:

(一)RNAlater的使用方法

1. RNAlater的簡介

 l產品描述 RNAlater是一種液態的，無毒的組織保存試劑。它能迅速穩定組織，保護非冷凍細胞RNA于原位。獲得組織塊后，迅速浸泡在RNAlater中保存，而不會引起RNA的降解，這樣可以不必馬上處理樣本或將樣本冷凍在液氮之中以備以后處理。 RNAlater應保存在室溫下，保質期6個月。如放置在4℃條件下則會引起沉淀，此時需加熱到37℃才可澄清。 RNAlater可廣泛應用于多種脊椎動物樣本。包括腦、心、腎、脾、肝、睪丸、骨骼肌、脂肪、肺和胸腺。RNAlater對大腸桿菌、果蠅、組織培養細胞、全血細胞和一些植物也有效。

 lRNAlater能否與RNA提取試劑盒兼容？ RNAlater可與大多數RNA提取方法相協調。特別是TRIReagent?, RNAwiz, TōTALLY RNA, RNAqueous, andPoly(A)Pure。

2. 如何使用RNAlater：

   RNAlater只能用于新鮮組織，在浸入RNAlater之前不能冷凍組織。簡單切碎組織樣本，任何一邊的**厚度不能大于12.5px, 然后將組織碎塊放入到5倍體積的RNAlater中保存。

 l動物組織 RNAlater不會溶解或破壞組織樣本的結構。如果需要的話，仍可將已經平衡在RNAlater溶液中的組織取出并分割成更小的塊再重新放入到RNAlater中。小器官如鼠肝、腎和脾可以完整地保存在RNAlater中。

 l植物組織 許多植物組織可以簡單浸泡在5倍體積的RNAlater中保存。具有自然屏障防止擴散的植物如蠟表皮的葉組織可能需要先破壞其屏障，以允許RNAlater進入組織

 l組織培養細胞 沉淀細胞，用PBS洗一次，再用少量的PBS懸浮細胞，然后加5~10倍體積的RNAlater保存。

 l白細胞 如果將白細胞從紅細胞和血清中分離出來，并按組織培養細胞一樣處理后，白細胞便能有效地保存在RNAlater中。不要將全血、血漿或血清中的RNA保存在RNAlater中，因為它們蛋白含量過高，與RNAlater混合后易形成不溶的沉淀。

 l細菌(以下內容是根據Ambion公司的產品說明書編譯的，僅供參考)

RNAlater是抑菌的，雖然細菌在RNAlater中不能生長，但細胞仍保持其完整性。大腸桿菌保存在RNAlater中4℃條件下1個月仍很完整，產生不降解的RNA。

3. RNAlater中樣品的保存

 l保存于-80℃ 建議用于批量保存。將樣本在4℃條件下孵育過夜，然后從RNAlater溶液中取出樣本保存于-80℃。對于組織培養細胞，不必移去RNAlater，只需簡單凍存整個溶液。實驗證明，細胞在-80℃條件下凍存于RNAlater溶液中并未出現溶解。樣本可隨后在室溫下解凍及再凍存，其RNA的質和量都不會受到影響。

 l保存于-20℃ 建議用于批量保存。將樣本在4℃條件下孵育過夜，然后轉移到-20℃。樣本在-20℃條件下不會凍結，但在存貯緩沖液中會有結晶形成，這并不影響隨后的RNA提取。樣本可隨后在室溫下解凍及再凍存，其RNA的質和量都不會受到影響。

 l保存于4℃ 廠家認為，目前尚無證據證明樣本存于4℃1個月內會出現RNA降解。

 l如果沒有冰箱： 將樣本放在盡可能冷的環境中。如果周圍溫度超過25℃，應盡可能使RNAlater中的樣本冰浴數小時。

4. RNAlater 中樣本的RNA提取

 l組織 用消毒鑷子將組織從存貯溶液RNAlater中取出，浸泡在RNA提取溶液中。一旦將組織放入RNA提取溶液中，勻漿一定要迅速進行。

 l細胞 從存貯在RNAlater中的細胞中提取RNA有兩種操作方法可供選擇：去除RNAlater或者從細胞與RNAlater的混合物中直接提取RNA。

5. 從RNAlater 中取出樣品

 l去除RNAlater 因為RNAlater的濃度比典型的細胞培養介質的濃度高，因此用通常沉淀活細胞的離心力無法沉淀RNAlater中的細胞。離心沉淀細胞，去除RNAlater。（HeLa細胞大約需要3000×g，但其他細胞可能不能容忍這個速度，或者他們需要更大的離心力。）

 l從RNAlater中的細胞直接提取RNA 作為選擇，我們可以用一步法破碎/提取溶液（如TRI Reagent和 RNAwiz　）從沒有去除RNAlater的細胞中純化RNA。這可通過向細胞混合物中加入10倍體積的一步提取溶液完成，其他照常。

(二)RNAsecure的使用方法

1. 簡介

在分子生物學試劑中用Ambion公司的RNAsecure代替DEPC，有很多優點：

1) 可以加入到不能用DEPC處理的溶液中（如：Tris或MOPS緩沖液）；

2) 可以加入到不能被高壓滅菌的溶液中；

3) 可以加入到加酶之前的酶促反應中。Ambion已經測試了有RNAsecure 試劑存在的如下酶促反應（先于酶加入）：RNA多聚酶T7，T3和SP6的體外轉錄（37℃），MMLV和AMV逆轉錄（42℃），以及SuperTaq PCR（94℃），均沒有出現酶抑制現象。

2. 使用方法

1) 用緩沖液或經過處理的溶液稀釋RNAsecure試劑到1×，充分混勻。

2) 將混合物在60℃水浴溫浴20 min，冷卻至室溫。這樣的溶液可備用于接下來的RNA提取和分析，或者保存于室溫、4℃或-20℃以備將來使用。

3) 為了消除任何可能發生在經過初處理之后的RNA酶的污染，在使用前可以將RNAsecure溶液在60℃水浴中重新溫浴10~20分鐘。

3. 注意事項

   RNAsecure試劑只在高于45℃的條件下才有活性，但當反應體系孵育溫度超過該溫度時可能會使一些酶失活。因此，用RNAsecure處理反應緩沖液時要以加入酶之前做為臨界點，然后進行酶促反應時孵育溫度低于45℃。注意：這不適用于Taq 多聚酶。