Quantitative analysis of proteomics

定量蛋白質組學是一種用來檢測樣品中蛋白相對/絕對含量的分析化學技術，而質譜則是實現該技術依賴的一個重要手段。基于質譜的蛋白質組學主要分為兩大類，即標記定量和非標記定量。其中，標記定量常用的是iTRAQ和TMT兩種試劑盒，其均是利用質譜檢測報告離子的信號相應強度來對蛋白進行相對定量的。而非標記定量的原理則是對被檢測到的離子峰強度進行積分，以積分面積進行相對定量的。近幾年備受關注的數據非依賴采集（Data Independent Acquisition）方式則是傳統非標記定量的升級版，能夠掃描到更全面地碎片信息，不會造成低豐度蛋白的丟失。

產品介紹

The service content

——iTRAQ 同位素標記定量技術

iTRAQ同位素標記定量技術

iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）技術是由美國應用生物系統公司AB研發的一種多肽體外標記技術。該技術采用4種或8種同位素的標簽，通過特異性標記多肽的氨基基團，然后進行串聯質譜分析，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量。

實驗原理

iTRAQTM試劑在結構上包括3個化學基團，分別是報告基團、平衡基團和反應基團。（如下圖1）

圖1：4plex iTRAQ分子結構。

不同樣品的同一肽段經iTRAQ試劑標記后具有相同的質量數，并在一級質譜檢測（MS1）中表現為同一個質譜峰。當此質譜峰被選定進行碎裂后，在二級質譜檢測（MS2）中，不同的報告基團被釋放，它們各自的質譜峰的信號強弱，代表著來源于不同樣品的該肽段及其所對應的蛋白的表達量的高低。

iTRAQ技術的特點

1、通量高

2、重復性好

3、靈敏度高

4、定量準確

5、數據豐富

6、自動化程度高

優勢

1、蛋白提取、濃度測定、蛋白酶切一站式服務

2、強大的項目團隊：擁有研究員、博士、高級外聘專家等數名

3、技術成熟：近10年的組學技術服務經驗，擁有完善的樣品處理體系

4、先進的儀器設備   

應用領域

疾病標志物篩選　　　　植物抗逆研究

發病機理研究　　　　　藥物靶點研究

特殊功能蛋白質篩選       作用機制研究

植物品種改良              　工程菌改造   

實驗流程

注：以iTRAQ 8標為例

樣本類型及含量要求

送樣要求

儀器設備

Thermo Q-Exactive高分辨質譜   

Sciex Triple TOF 6600質譜儀

服務流程

① iTRAQ / TMT 定量蛋白質組和雙向電泳技術相比，有什么優勢？

雙向電泳技術是伴隨著 MALDI-TOF 技術發展起來的蛋白質分離技術，理論上可以通過等電點（IEF）和分子量（SDS-PAGE）的差異將總蛋白質逐一分開。但實際情況并不理想，因為低豐度蛋白無法染色成功而看不見，蛋白翻譯后修飾后偏離理論位置等等，一張 2-D膠能鑒定到的蛋白質總數最多 1000 - 2000 蛋白。相較于2-D以及 DIGE 等基于電泳的技術，iTRAQ / TMT 分辨率高，細胞樣品最多有發現超過 6000 個蛋白，并且絕大多數蛋白都有定量和定性信息；其次 iTRAQ/TMT 通量高，可以一次最多完成 8 或10個不同處理組的實驗，特別適合于多組樣品間的同時比較以及生物學過程的動態檢測。

② iTRAQ / TMT 實驗的主要步驟有哪些，主要采用哪些儀器，檢索的軟件及常用數據庫有哪些？

實驗步驟包括：蛋白提取、濃度測定及 SDS-PAGE 凝膠檢測，質檢報告；蛋白酶解、標記；一維色譜分離，凍干機凍干；高分辨 LC-MS/MS 質譜檢測；搜庫定性、定量分析；差異蛋白篩選，差異蛋白生物信息學分析；完整報告整理。目前質譜儀器有：Sciex公司 6600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive、Fusion質譜儀。常用的檢索軟件有：SCIEX公司ProteinPilot 5.0、Thermo 公司Proteome Discoverer。常用的數據庫有：Uniprot數據庫、NCBI數據庫、本地自建數據庫。

③iTRAQ、TMT、Label free 實驗用的是什么質譜儀，其定量是基于一級質譜還是二級質譜？

iTRAQ、TMT、Label free都屬于蛋白組學實驗，前二者是屬于同位素標記定量蛋白組二者的原理都一樣；第三個是非標記定量蛋白組。 三者所用的儀器都差不多，主要有：Sciex公司 5600 Triple TOF、Thermo 公司Q Exactive； PS: TMT 10標蛋白組只能用thermo公司Q Exactive，不能用AB 5600 做。 Itraq、TMT是基于二級質譜定量，Label free是基于一級質譜定量。

TMT同位素標記定量技術

       TMT（tandem mass tags）是由Thermo公司開發的一種體外標記技術，廣泛用于差異表達蛋白質分析研究中。該技術采用多重同位素標簽與肽段的氨基發生共價結合反應，可實現同時對不同樣品中蛋白質的定性和定量分析（目前最多可實現同時標記16個樣本）。

實驗原理

     如下圖所示，TMT試劑在結構上包括3個化學基團，分別是報告基團、平衡基團和反應基團。反應基團特異與肽段的氨基發生共價結合反應，將TMT試劑連接到肽段上。在一級圖譜中，不同樣品來源于同一個蛋白質的同一個肽段由于被連接上總質量相同的完整TMT試劑而表現為一個峰。但在碰撞室內，平衡基團會發生中性丟失，而報告基團則會產生相應的報告離子（六標為126、127、128、129、130和131 Da，十標為126、127N、127C、128N、128C、129N、129C、130N、130C和131 Da，十六標為126、127N、127C、128N、128C、129N、129C、130N、130C、131N、131C、132N、132C、133N、133C、134N）。這些報告離子的強度就代表了相應樣品蛋白質/肽段的強度，實現了對6個/10個/16個不同樣品的同時定量。

TMT技術特點

1、通量高：可一次性分析6、10、16個樣品。

2、重復性好：所有樣品的分離鑒定條件一致。

3、數據豐富：   可獲得所有蛋白的定性和定量信息。

4、自動化程度高：以高分辨率液質聯用為基礎，自動化操作，分析速度快。

5、定量準確：減少了樣本處理、以及不同組上機造成的實驗誤差，因此能達到定量更準確的效果。

6、靈敏度高：可檢測到表達豐度為皮克（pg)級的蛋白，無高豐度蛋白樣本（血液、腦脊液、肌肉組織、骨組織等）可檢測。

DIA技術

數據非依賴采集（data independent acquisition，DIA）是近年來備受矚目的質譜采集技術之一，一度引領了定量蛋白質組學新發展。

DIA相比于DDA的**的優勢在于高效測定復雜樣品中豐度極低的蛋白分子，極大地提高了定量分析的可信度。其原理是在質譜數據采集時，高速、循環的將每個采集窗口內的所有母離子及其子離子碎裂后進行全掃描，而非根據母離子信號強度篩選后進行二級碎片再掃描。因此DIA具有高通量、高分辨率、高可重現性、定量準確等優點，而且樣本無需分級上機，極大的縮短了每個樣品的檢測時間，適合大樣本量的蛋白質組研究。但由于DIA獲得的是幾乎沒有任何丟失的所有離子信息，數據量及其復雜性大大增加，數據分析難度加大。目前主流的數據分析是基于 DDA/DIA 構建的譜庫和實驗產生的 數據對樣品中的蛋白質進行鑒定和定量。公共的譜庫可以從各大蛋白質組研究數據平臺下載，但對于一些特異性的樣本，為了有更好的鑒定結果，還需要通過實驗樣本建立DDA參考數據庫。

提取的蛋白酶解之后，利用液質聯用技術對肽段進行質譜分析，通過比較不同樣品中相應肽段的信號強度，從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量。每條肽段的豐度（量）與其在質譜中的峰面積或信號強度成正比；而不同樣品的同一條肽段在LC上的保留時間（retention time， RT）是一致的，因此，可以通過對比譜圖庫中的信息，再整合到相應蛋白，實現對蛋白質在不同樣本中的相對表達水平的定量分析。

（1）重現性好：采集所有離子及碎片譜圖，不丟失任何信息；

（2）選擇性好：基于碎片離子（即母子離子對）定量，與 SRM/MRM 相當；

（3）準確度高：循環時間固定，掃描點數均勻，定量準確度高；

（4）通量高：同時監測所有目標蛋白/ 化合物，通量無上限；

（5）時效性強：對于易降解樣品可以即刻采集，獲得數據后再深入挖掘；

（6）數據易追溯：即使目前的水平無法發現某些蛋白/化合物，未來可以回溯

臨床疾病標志物的篩選

作用機制研究

藥物作用靶點研究

疾病的分子分型

磷酸化靶點研究

癌癥血清標志物的篩選與驗證

DIA技術:先利用常規DDA質譜檢測技術分析建立圖譜庫，之后采用DIA方法進行質譜數據采集，從而實現對樣品中蛋白質的定性及定量，不同于傳統的DDA技術，DIA技術將質譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，高速、循環地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測，因此可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息，數據利用度大大提高，缺失值更少。因此，DIA技術更適合于大樣本量、復雜體系的蛋白檢測。

PRM技術：平行反應監測(Parallel Reaction Monitoring) 是一種基于高分辨、高精度質譜的離子監視技術，能夠對目標蛋白質、目標肽段（如發生翻譯后修飾的肽段）進行選擇性檢測，從而實現對目標蛋白質/肽段進行相對或絕對定量。PRM技術是基于質譜的靶向驗證蛋白組學技術，完美的替代了基于抗體的Western blot、ELISA等。PRM技術運用平行反應監測技術特異性地選擇與預先設定質荷比相同的肽段離子并進行定量，可以有效排除干擾離子，提高蛋白質的定量準確性。

技術的特點

DIA技術是基于質譜的新一代蛋白組學技術，DIA技術采用數據非依賴性采集掃描模式，擺脫了傳統DDA（代表性技術：iTRAQ/TMT）掃描的偏好性制約，可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的碎片信息，以達到樣本數據的完整性。

DIA技術較傳統的iTRAQ/TMT/Labelfree蛋白組技術而言，具有如下優勢：

1. 保證了數據的完整性，缺失值少。

2. 克服了iTRAQ/TMT的通量低的限制。

3. 提高了低豐度蛋白的檢出率。

4. 基于Thermo公司的QE-HF高端質譜，檢出率提升20%以上。

DIA實驗流程

PRM實驗流程

基于Thermo公司的QE-HF高端質譜，檢出率提升20%以上。